| Вы не авторизованы! [ Войти
] | [ Регистрация ] |
|
| Форум » Теория » Тема: Лекция №5 Методы биохимического анализа (ОАК, ИФА, ПЦР) -- Страница 1 |
Перейти в: |
|
|
|
Юнона
Зарегистрированный пользователь
Из: планета Земля)
Сообщения: 218
|
 |
Лекция №5 Методы биохимического анализа (ОАК, ИФА, ПЦР) |
|
| Отправлен: 02-12-2014 18:05 |
|
|
Лекция №5 Методы биохимического анализа (ОАК, ИФА, ПЦР)
Биохимический анализ крови и результаты, которые он отображает. Расшифровка результатов анализов.
Для того чтобы получить полное представление о работе того или иного органа тела человека, уже не одно десятилетие успешно применяют метод биохимическогоанализа крови. Это один из способов лабораторной диагностики, который очень информативен для врача и отличается высокой степенью достоверности. Биохимический анализ кровине только раскроет полную картину функционирования того или иного органа, но и расскажет, испытывает ли человек недостаток в том или ином микроэлементе или витамине. Области медицины, которые используют результаты биохимическогоанализа крови в своей практике, это — гастроэнтерология, урология, терапия, кардиология, гинекология и другие.
Даже если у вас нет никаких проявлений болезни, и вы чувствуете себя совершенно здоровым, биохимический анализ крови поможет установить, какой из органов плохо справляется со своей задачей и работает не так, как положено. Любое изменение в химическом составе крови свидетельствует о неблагополучной ситуации и необходимости срочного вмешательства.
Для того чтобы сделать биохимический анализ крови, у пациента из локтевой вены берется около 5 мл крови. Изучение биохимического анализа крови направлено на выявление ее состава, результаты исследования заносят в специальный бланк. В немперечислены основные компоненты и их содержание в крови пациента. Врач сравнивает результаты анализа крови с теми цифрами, что являются общепринятыми и эталонными для анализов крови здоровых людей. Значения биохимических анализов крови могут разниться в зависимости от пола или возраста больного.
Все показатели химических анализов крови обычно не имеют четких значений, а определяются относительно предельных параметров, т. е. рамок между их минимальной и максимальной величиной. Очень часто один и тот же анализ крови трактуют по-разному – это связано с тем, что специфика каждой клиники устанавливает для себя критерии, по которым оценивается результат биохимических анализов крови. Опытный врач легко сопоставит результаты анализа крови и симптоматику заболевания, и на их основании вынесет вердикт.
Биохимический анализ крови вы легко можете сдать в любой клинике своего города. Требуется, чтобы перед забором крови пациент не пил и не ел -в этом случае результаты анализов будут наиболее достоверны. Как правило, его выполняют в течение одного дня или даже, по желанию пациента, применяют экспресс-метод.
Биохимический анализ подразумевает лабораторное исследование следующих показателей анализа крови:
• Белки
• Альбумин
• Общий белок
• С-реактивный белок
• Гликированный гемоглобин
• Миоглобин
• Трансферрин
• Ферритин
• Железосвязывающая способность сыворотки (ЖСС)
• Ревматоидный фактор
• Ферменты
• Аланинаминотрансфераза (АлАТ)
• Аспартатаминотрансфераза (АсАТ)
• Гамма-глутамилтрансфераза (Гамма-ГТ)
• Амилаза
• Амилаза панкреатическая
• Лактат
• Креатинкиназа
• Лактатдегидрогеназа (ЛДГ)
• Фосфатаза щелочная
• Липаза
• Холинэстераза
• Липиды
• Общий холестерин
• Холестерин ЛПВП
• Холестерин ЛПНП
• Триглицериды
• Углеводы
• Глюкоза
• Фруктозамин
• Пигменты
• Билирубин
• Билирубин общий
• Билирубин прямой
• Низкомолекулярные азотистые вещества
• Креатинин
• Мочевая кислота
• Мочевина
• Неорганические вещества и витамины
• Железо
• Калий
• Кальций
• Натрий
• Хлор
• Магний
• Фосфор
• Витамин В12
• Фолиевая кислота
Существуют определенные нормы биохимического анализа крови — т. е. то количество показателей, которое должно присутствовать в крови человека определенного возраста и пола. Это статистически установленные показатели здоровых людей. Отклонение от этих показателей — симптом разнообразных нарушений в деятельности организма, сбой в работе определенных органов или систем.
Казалось бы, получив результаты анализа крови, нет ничего проще, чем сопоставить показатели биохимического анализа крови и нормы для этого анализа и самостоятельно поставить диагноз. Однако полученные результаты биохимического анализа крови могут говорить о совершенно независимых друг от друга заболеваниях. Верно оценить состояние Вашего здоровья, дать правильную, достоверную расшифровкубиохимического анализа крови может только профессионал — опытный и квалифицированный врач.
Необходимо понимать, что использование разных методов диагностики различными клиниками, показывают различные результаты, потому что до сих пор в различных лабораториях существуют различия в единицах измерения. Поэтому не всегда показатели вашего биохимического анализа крови — норма или отклонение. Для детальной и правильной интерпретации результата вашего анализа все равно понадобится консультация профессионального врача, потому что доктор оценивает не только результаты анализа, но и, как минимум, ваши жалобы и симптомы заболевания
Подготовка к сдаче биохимического анализа крови
На точность и достоверность результатов анализа влияет, правильной ли была подготовка к биохимическому анализу крови, и соблюдали ли Вы рекомендации врача. Врачи советуют делать биохимический анализ крови в утренние часы и СТРОГО натощак. Перед забором крови на анализ не рекомендуется не только не есть, но и не пить, не жевать жвачку и т.д.
Гематологические анализаторы.
Принцип работы гематологических анализаторов.
На сегодняшний день существует ряд фирм, производящих гематологические анализаторы. Наиболее известные аппараты GENYS, Hemascreen, Medonic, Mimer, Micros.
Все они имеют ряд своих преимуществ и недостатков, но в их основе положен следующий принцип работы:
Принцип проточной цитометрии.
Клеточная суспензия попадает в поток жидкости, проходящий через проточную ячейку. Условия подобраны таким образом, что клетки выстраиваются друг за другом за счет так называемого гидродинамического фокусирования струи в струе. В момент пересечения клеткой лазерного луча детекторы фиксируют рассеяние света под малыми углами (от 1° до 10°) и рассеяние света под углом 90° клеток.
Далее, состав и характеристики крови определяют по трём параметрам: электрическому сопротивлению, ёмкости и светорассеянию. Эти характеристики определяются следующими методами:
А) V=Volume
Метод, лежащий в основе подсчета клеток и определения их объема (принцип Культера), основан на изменении сопротивления в электрической цепи при прохождении подсчитываемых частиц через микроотверстие. Амплитуды образующихся при этом импульсов пропорциональны размерам клеток, а их количество — числу клеток.
Б) C=Conductivity
Емкостные характеристики клеток, дают информацию об их внутренней структуре, в том числе плотность и размеры ядра, а также позволяют определить электрическую непрозрачность клетки и оценить сигнал проводимости. Используются для определения размера ядра, его плотности, соотношения ядро/цитоплазма, а также для выявления клеток одного размера, но разной внутренней структуры.
В) S=Scatter
Характеристики светорассеяния позволяет оценить рассеяние лазерного излучения неокрашенными клетками, получить информацию о гранулярности и структуре поверхности клеток, сегментированности ядер, а также позволяет классифицировать субпопуляций лейкоцитов и ретикулоцитов.
Г) Принцип “VCS”
Уникальное сочетание трёх способов измерения позволяет быстро, с высокой чувствительностью и достоверностью проводить гематологические исследования, включая дифференцировку популяций лейкоцитов и оценку ретикулоцитов.
В современных приборах часто используются дополнительные приёмы для повышения точности исследований; такие как IntelliKinetics — процесс подготовки образца, осуществляемый в приборе, автоматически корректируется в зависимости от условий окружающей среды (изменение времени инкубации, объема лизирующих реагентов т.д.).
AccuGate — программное обеспечение, позволяющее с высокой точностью и достоверностью оценивать изменения параметров клеток (объема, электрической проводимости и непрозрачности, светорассеяния).
В результате исследования крови на гематологических анализаторах получают следующие параметры: WBC, RBC, Hgb, Hct, MCV, MCH, MCHC, RDW, Plt, MPV, PDW, Pct, LY%, LY#, MO%, MO#, NE%, NE#, EO%, EO#, BA%, BA#, RET%, RET#, MRV, MSCV, IRF, HLR%,HLR# (количество параметров разное для разных аппаратов).
Определяемые параметры:
WBC – Лейкоциты
RBC – Эритроциты
Hgb – Гемоглобин, г/л
Hct – Гематокрит, %
MCV – Средний объем эритроцитов
MCH – Среднее содержание гемоглобина в эритроците
MCHC – Средняя концентрация гемоглобина в эритроците
RDW – Показатель гетерогенности эритроцитов
Plt – Тромбоциты
MPV – Средний объем тромбоцитов
PDW –Показатель гетерогенности тромбоцитов
Pct – Тромбокрит
LY% – Лимфоциты, %
LY# – Лимфоциты, мкл
MO% – Моноциты, %
MO# – Моноциты, мкл
NE% – Нейтрофилы, %
NE# – Нейтрофилы, мкл
EO% – Иозонофилы, %
EO# – Иозонофилы, мкл
BA% – Базофилы, %
BA# – Базофилы, мкл
RE% – Ретикулоциты, %
RE# – Ретикулоциты, мкл
MRV* – Средний объем ретикулоцитов
IRF* – Коэффициент зрелости ретикулоцитов
HLR%* – Зрелые ретикулоциты, %
HLR#* – Зрелые ретикулоциты, мкл
MSCV* – Сферичность
На основе полученных параметров можно получить важные характеристики исследуемой крови:
• Гистограммы распределения эритроцитов и тромбоцитов.
• Подсчет пяти субпопуляций лейкоцитов.
• Выявление наличия в образце незрелых и патологических клеток.
• Определение ретикулоцитов.
• Соотношение клеток, экспрессирующих CD4 и CD8.
Реагенты для гематологических анализаторов.
Среди анализаторов, которые работают на реагентах РЕАМЕД, имеются как самые простые полуавтоматические анализаторы, так и самые сложные полностью автоматические анализаторы с дифференциацией лейкоцитов на три популяции. Многолетний опыт успешной эксплуатации нескольких сотен анализаторов по всей России с реагентами РЕАМЕД, а также результаты испытаний в Минздраве РФ и имеющиеся сертификаты Госстандарта подтверждает качество реагентов. Шведская фирма Boule Medical, производитель гематологических анализаторов марки МЕДОНИК, в 1999 г. официально одобрила использование реагентов РЕАМЕД в своих анализаторах. Положительные результаты были получены при испытаниях реагентов на фирме ДИАТРОН (Австрия) в 2000 г для анализаторов АБАКУС. По ряду характеристик реагенты РЕАМЕД находятся на уровне лучших мировых образцов. Каждый гематологический анализатор, как правило, рассчитан на свою собственную реагентную систему, однако между ними есть много общего.
Основными составляющими комплектов реагентов для гематологических анализаторов являются: а) изотонический разбавитель; б) лизирующий раствор; в) промывающий раствор (после каждой пробы); г) промывающий раствор (для глубокой очистки системы); n очищающий раствор (для экстренной очистки датчика и/или сервисных работ).
В зависимости от конкретной конструкции анализатора в базовый комплект может входить лишь часть указанных реагентов. Изотонический разбавитель — это буферный раствор с фиксированными параметрами рН, электропроводности и осмолярности. Слово «изотонический» указывает только на одно и не самое важное свойство реагента – поддержание требуемого осмотического давления с целью обеспечения постоянства объема клеток крови. Дело в том, что эритроциты принимают тот объем, который им диктует осмолярность раствора. При увеличении осмолярности, в течение 3…5 сек эритроциты сжимаются до некоторого равновесного объема. Если осмолярность раствора уменьшается, объем эритроцитов, соответственно, увеличивается. Таким образом, средний объем эритроцитов (MCV) увязывается с осмолярностью изотонического разбавителя. Стабилизирующие добавки в изотоническом разбавителе должны обеспечивать сохранность форменных элементов крови в течение достаточно длительного времени в первом разведении крови. Присутствие в растворе антикоагулянта должно эффективно предотвращать образование фибриновых сгустков и агрегацию тромбоцитов. В случае гематологических анализаторов, проводящих дифференциацию лейкоцитов на три популяции, изотонический разбавитель содержит специальные добавки, модифицирующие мембраны лейкоцитов. В этом случае изотонический разбавитель должен применяться в согласованной паре с соответствующим лизирующим раствором. Следует иметь в виду, что для всех гематологических анализаторов с дифференциацией лейкоцитов на три популяции штатным режимом является работа с цельной кровью. В варианте работы с предилюцией время стояния пробы крови в первом разведении по инструкциям фирм изготовителей не должна превышать 30…60 мин., что трудно осуществимо в практике российских лабораторий, преимущественно использующих именно режим предилюции. Исходя из требований практики отечественных лабораторий, специально разработан уникальный изотонический разбавитель, в котором дифференциация лейкоцитов сохраняется вплоть до 3 ч стояния проб крови в первом разведении. Другим важнейшим реагентом является лизирующий раствор (гемолитик), который при добавлении в разведение крови приводит к лизису эритроцитов и в то же время сохраняет лейкоциты. Необходимо, чтобы гемолиз эритроцитов был качественный, поскольку в гемолизате подсчитываются лейкоциты, которых первоначально примерно в 1000 раз меньше, чем эритроцитов. Для обеспечения этих свойств лизирующий раствор, как правило, содержит сложную композицию ионных поверхностно-активных соединений. Современные гемолитики РЕАМЕД обеспечивают быструю реакцию и высокую степень отделения лейкоцитов от стромы независимо от настройки дискриминатора конкретного прибора. В анализаторах с дифференциацией лейкоцитов на три популяции лейкоциты под действием лизирующего раствора изменяют свои размеры так, что выделяются фракции лимфоцитов (первый пик лейкоцитарной гистограммы, 35…90 куб. мкм), гранулоциты (крайний правый пик лейкоцитарной гистограммы, 120…400 куб. мкм). В средней части гистограммы (90…120 куб. мкм) в области так называемых «средних» клеток расположены моноциты, базофилы и эозинофилы. Таким образов гематологический анализатор по анализу размера клеток может определять процентную и абсолютную концентрацию лимфоцитов, гранулоцитов и «средних» клеток (суммарно моноциты, базофилы и эозинофилы). Наряду с факторами пробоподготовки свойства реагентной системы оказывают существенное влияние на качество дифференциации лейкоцитов. Промывающие растворы непосредственно не участвуют в процессе измерения, однако их свойства существенно влияют на стабильность аналитических характеристик анализаторов. Характерной особенностью гематологических анализаторов, использующих принцип Культера, является наличие счетных апертур малого диаметра. А, как известно, кровь содержит в себе ряд веществ, которые имеют тенденцию осаждаться на апертуре и внутренней поверхности гидравлической системы. Это постепенно приводит к засорам и ошибочным результатам. В некоторых случаях прибор просто останавливается и требует капитальной чистки. То есть качество промывающих растворов влияет на долговременную стабильность работы прибора. Промывающие растворы бывают, в основном, трех типов. Первый тип – растворы для мягкой промывки магистралей анализатора между пробами, и они не несут в себе особых моющих свойств. Такие растворы имеют в своем составе поверхностно – активные вещества (детергенты). К сожалению, детергентные промывающие растворы практически не отмывают белки. Поэтому для очистки от белковых осадков применяют растворы на основе гипохлорита натрия – второй тип промывающих растворов. Эти растворы являются очень сильными депротеинезаторами. Однако, раствор гипохлорита натрия – это очень едкое вещество, и долгого контакта с ним не выдерживают детали из пластика (они трескаются), металла (они подвергаются коррозии). Поэтому злоупотреблять такими растворами нельзя. Данные растворы в основном применяются в экстренных случаях, когда необходимо быстро очистить счетную апертуру, а также для сервисных работ. Современное решение проблемы качественной промывки прибора – применение ферментативных промывающих растворов. Благодаря наличию ферментов, такие растворы эффективно удаляют адсорбированные на стенках гидравлической системы белки и другие вещества. При этом они совершенно нейтральны и не оказывают вредного действия на детали прибора. Трудность создания таких промывающих растворов заключается в известном свойстве ферментов быстро терять активность. Вследствие этого, в мире имеется сравнительно немного фирм производителей ферментативных промывающих растворов. И здесь следует отметить, что в комплекте реагентов РЕАМЕД имеются уникальные ферментативные промывающие растворы, которые сохраняют свою активность в течение года даже при комнатной температуре. В настоящее время в составе гематологических реагентов РЕАМЕД имеется весь спектр растворов, необходимых для качественной и надежной работы гематологических анализаторов. Это весьма благоприятный фактор для более широкого внедрения гематологических анализаторов в лабораторной практике, учитывая существенно более низкие цены на отечественные реагенты.
Гематологические анализаторы GENџS
Полностью автоматизированный гематологический анализатор GENYS — это надежный и простой в обращении прибор, позволяющий проводить исследование крови по 29 параметрам, включая дифференцировку лейкоцитов на 5 популяций, автоматическое определение ретикулоцитов, а так же получать гистограммы распределения эритроцитов и тромбоцитов.
Благодаря высокой производительности, аналитической точности и чувствительности, GENYS может быть использован в крупных клинико-диагностических лаборатория не только для проведения клинических анализов, но и в научных целях. Реализованные в приборе новейшие технологии и технические решения позволяют считать гематологический анализатор GENYS наиболее прогрессивным прибором в области клинических исследований крови. GENYS является прибором, в котором принцип проточной цитометрии сочетается с уникальным VCS-методом.
Объем образца
При работе с открытыми пробирками — 200 мкл.
При использовании закрытых пробирок — 280 мкл.
В режиме предварительного разведения — 50 мкл.
При автоматическом приготовлении мазка крови — дополнительно 250 мкл.
Производительность
При определении количества клеток крови (CBC) производительность — до 120 анализов в час.
При определении CBC и дифференциации лейкоцитов — до 109 анализов в час.
При определении CBC+дифференциация лейкоцитов+ретикулоциты — до 50 анализов в час.
Максимальная загрузка анализатора — 144 образца.
Автоматический гематологический анализатор» CA-530 MIMER»
Новая серия высокоинтегрированных и компактных анализаторов с открытым доступом к расходным реагентам, с превосходными техническими характеристиками и уникально низкой ценой. Возможны три модели, определяющие 9, 16 и 20 параметров клеток крови соответственно. В приборе этой серии предусмотрен ввод проб как цельной, так и разведенной крови из открытого контейнера или капилляра. Все параметры выводятся на монитор в течение 1мин. Низкий расход реагента и прочный металлический корпус позволяет эксплуатировать эти анализаторы долгое время в Вашей лаборатории. Базовый анализатор этой серии СА 530 MIMER является, возможно, первым полностью автоматизированным прибором, который можно приобрести за цену полуавтоматического анализатора. MIMER определяет 9 базовых параметров клеток крови, включая тромбоциты, менее чем за минуту. Программное обеспечение позволяет переинсталлировать прибор для определения 16 или 20 параметров.
1. Время исследования одной пробы крови — 60 сек., производительность — 60 проб крови в час.
2. Анализаторы МЕДОНИК имеют высокую устойчивость к засорению.
Новый метод самоочистки датчика — автоматическая ультразвуковая очистка (прожиг) апертуры, которая производится по результатам внутреннего самотестирования даже при незначительном сужении отверстия апертуры. Автоматическая промывка анализатора после каждой пробы. Автоматическая промывка прибора через каждые 4 часа, что предупреждает появление засоров и снимает необходимость ежедневной ручной промывки прибора.
Если все-таки засорение произошло, то анализатор вывешивает флаги, предупреждающие о засорении анализатора. В связи с этим выдача следующего после засорения результата становится невозможной. Анализатор сначала автоматически ликвидирует засорение, а затем даст сигнал к возобновлению работы.
Совет инженера: Частота засоров четко коррелирует с аккуратностью работы на анализаторе и используемыми материалами, поэтому для снижения количества засорений используйте безворсовые салфетки, а при работе с цельной кровью тщательно перемешивайте пробу в пробирке во избежание образования сгустков.
3.Анализаторы МЕДОНИК работают как с цельной кровью, так и в режиме предилюции.
4.Высокая точность получаемых результатов. При определении концентрации клеток в гематологических анализаторах серии МЕДОНИК определяется, сколько клеток находится в строго определенном объеме (контроль объема осуществляется при помощи оптических датчиков), в отличие от других анализаторов, где определяется, сколько клеток прошло через апертуру за определенное время (при осаждении белка на апертуре скорость прохождения уменьшается, что приводит к занижению реальной концентрации клеток).
В анализаторах МЕДОНИК предусмотрен поворотный клапан. Кроме того, что он обеспечивает исключительно высокую точность дозирования, он еще и снимает необходимость постоянной подкалибровки прибора во время его эксплуатации. Объем поворотного клапана — 20 мкл. Поворотный клапан чрезвычайно надежен в эксплуатации (гарантийный срок его использования — 5 лет), ему не надо менять предохранительные кольца за отсутствием таковых, естественно, сама собой отпадает проблема изменения объема дозирования из-за подтекания колец, присущая анализаторам со шприцевой системой.
5. Реагенты.
Для работы анализаторам МЕДОНИК требуется всего 2 реагента — изотонический и лизирующий раствор. Это позволяет сократить расходы на приобретение дорогостоящих промывающего и очищающего растворов.
Анализаторы МЕДОНИК комплектуются отечественными реагентами марки ЮНИ-ГЕМ, что позволяет значительно снизить себестоимость анализа. Стоимость одного анализа на анализаторах МЕДОНИК составляет всего 13 центов. Реагенты ЮНИ-ГЕМ лицензированы шведской фирмой Boule Medical AB, производителем гематологических анализаторов.
6. Анализаторы МЕДОНИК имеют автоматический переход в режим ожидания, во время которого также производится автоматическая промывка каждые четыре часа.
7. Наличие плавающих дискриминаторов повышает точность разделения лейкоцитов на 3 популяции, а также повышает точность подсчета эритроцитов и тромбоцитов.
8. В памяти анализатора сохраняются результаты измерений последних 350 анализов.
9. Интерфейс: RS 232. Программа работы с компьютером — передача данных, база данных по пациентам, контроль качества.
Гематологические анализаторы Coulter Ac Т 8,Ас Т10
Новое поколение гематологических анализаторов фирмы BECKMAN COULTER представлено моделями Ас Т 8 и Ас Т10, которые предназначены для проведения количественных и качественных исследований крови в клинико-диагностических лабораториях с небольшим объемом исследований.
Автоматизированный процесс исследования образцов с применением патентованного метода подсчета клеток и определения их объема, использующий «принцип Культера», в сочетании с высокой производительностью, надежным контролем точности и простым управлением обуславливают высокую эффективность работы гематологических анализаторов Ас Т 8 и Ас Т10. Приборы чрезвычайно просты и удобны в эксплуатации: они готовы к работе сразу же после включения, а пиктограммы на экране подсказывают оператору дальнейшие действия. Реактивы, используемые при работе анализаторов, поставляются со специальными «карточками управления», которые содержат информацию о реактиве и данные для калибровки прибора. В качестве образцов может быть использована как цельная (венозная или капиллярная), так и разбавленная кровь.
Гематологические анализаторы Ас Т 8
Гематологический анализатор Ас Т 8 предназначен. для проведения качественных и количественных исследований клеток крови и определения содержания гемоглобина. Он позволяет оценить 8 параметров крови, в том числе: эритроциты, лейкоциты, гемоглобин, гематокрит, среднее содержание и среднюю концентрацию гемоглобина в эритроцитах, средний объем клеток, тромбоциты.
Гематологические анализаторы Ас Т 10
Наряду с параметрами, определяемыми Ас Т 8, прибор этой модели определяет содержание лимфоцитов, как в процентном отношении, так и в абсолютных единицах. Использование анализатора Ас Т 10 дает возможность проведения частичного дифференциального анализа лейкоцитарной фракции крови, что очень важно для исследования образцов с той или иной формой патологии.
Гематологические анализаторы Beckman Coulter полностью отвечают самым высоким требованиям специалистов клинических и научных лабораторий, обеспечивая получение достоверных и точных результатов с максимальной эффективностью.
Производительность
До 50 анализов в час
Продолжительность одного исследования — 60 секунд
Объем образца
Венозная или капиллярная кровь — 12 мкл
Разбавленная кровь — 20 мкл
Использование модели AcT10 дает возможность проведения частичного дифференциального анализа лейкоцитарной фракции крови, что очень важно для исследования образцов с той или иной формой патологии.
Точность и достоверность
-Трехкратный подсчет клеток в каждой пробе
-Апертурный мониторинг (детекция размеров апертуры и устранение засорений, влияющих на достоверность подсчета)
-Специальные контрольные материалы
-Сообщение об отклонении от нормального проведения исследования
-Реактивы поставляются со специальными «карточками управления»
-Сортировка импульсов (возможность получения идеальной кривой)
-Запатентованная система «Sweep Flow», исключающая повторное попадание уже подсчитанных клеток в зону счета
Простота и удобство эксплуатации
Отбор очередной пробы из пробирки осуществляется нажатием одной кнопки.
-Прибор не требует ежедневного обслуживания
-Автоматическое выполнение калибровки
-В качестве образцов используется как цельная (венозная и капиллярная), так и разбавленная кровь
-Прибор готов к работе сразу же после включения
-Каждой последующей пробе автоматически присваивается шестизначный идентификационный номер
-Сенсорный экран с пиктограммами
-Получение результатов менее чем за 60 секунд
Методы исследования
-Подсчет клеток и определение их объема, используя «принцип Культера»
-Трехкратный подсчет клеток в каждой пробе
-Увеличение продолжительности подсчета тромбоцитов при их низкой концентрации
-Цианометемоглобиновый метод определения гемоглобина
-Специальный метод подсчета тромбоцитов (метод экстраполяции кривой), исключающий влияние эритроцитов на результаты измерений
Автоматизированный процесс анализа образцов с применением запатентованного метода фирмы COULTER в совокупности с высокой производительностью, надежным контролем точности и простым управлением, определяют эффективность работы гематологических анализаторов серии Аc Т.
Эти компактные приборы имеют сенсорный экран с пиктограммами, что позволяет одним прикосновением выбирать режим исследования крови (цельная или разведенная), выводить результаты анализов на принтер, передавать данные на компьютер, а также извлекать из памяти прибора результаты проведенных ранее анализов.
Реактивы, используемые при работе анализаторов, поставляются со специальными “карточками управления”, которые содержат информацию о реактиве и калибровочные данные. При проведении анализов эта карточка помещается в гнездо на передней панели анализатора, и прибор автоматически считывает всю необходимую информацию.
Иммуноферментный анализ (ИФА, ELISA). Суть, принцип метода и этапы исследования. Анализ на антитела, классы антител, иммунный комплекс.
В связи с развитием клеточных технологий, молекулярной биологии, генетики, физики, химии и ряда других высокотехнологичных дисциплин в повседневную практику внедряются новые высокоточные и высокотехнологичные методы. Данные междисциплинарные тенденции затрагивают и область медицинских знаний, и смежные области биологических, биохимических проблем. За последние десять лет получил широкое распространение и внедрение в массовую практику метод клинической лабораторной диагностики под названием иммуноферментный анализ.
Вообще технологии иммунологических ферментативных и радиологических реакций широко использовались в типировании клеток, культур клеток, различных тканей с начала 80-х годов XX столетия. Однако методы эти были очень трудоемкими, не унифицированными, не стандартизированными, что исключало их использование в лечебно-диагностических целях в массовом порядке. Такими методами пользовались лишь узкие, наукоемкие и высокоспециализированные лаборатории.
Однако с развитием техники, микротехники, производства различных биополимерных материалов стало возможным производить готовые наборы иммуноферментной диагностики, которыми смогут пользоваться лаборатории лечебно-профилактических учреждений широкого профиля. ИФА широко используется для диагностики всевозможных инфекций (хламидиоз, сифилис,цитомегаловирус, токсоплазмоз, герпес и т.д.), как острых, так и хронических, а также скрытых форм, которые протекают без клинических симптомов.Также этот метод применяют для контроля над хроническими заболеваниями. Давайте постараемся разобраться, что это за метод, и какие принципы лежат в его основе?
Компоненты иммуноферментного анализа – иммунная реакция и ферментативная реакция
Иммуноферментный анализ, как видно из названия, состоит из двух разных компонентов – иммунной реакции и ферментативной реакции. Иммунная реакция производит связывание биологических молекул, элементов клетки или микроорганизма, которые собственно и пытаются обнаружить, а ферментная реакция позволяет увидеть и измерить результат иммунологической реакции. То есть иммунная реакция – это часть комплексной методики, которая собственно обнаруживает искомый микроб. А ферментная реакция – это та часть комплексной методики, которая позволяет перевести результат иммунной реакции в форму, видимую глазом, и доступную для измерения рутинными химическими методиками. Исходя из такой структуры метода иммуноферментного анализа, разберем обе его части по отдельности.
Иммунная реакция, что это? Что такое антитело, антиген?
Что такое иммунная реакция? Что такое антиген?
В первую очередь разберем, что такое иммунные реакции. Иммунные реакции – это специфические реакции связывания антигена с антителом с образованием иммунного комплекса. Что это значит? На поверхности каждой клетки любого организма имеются особые структуры, которые называются антигены. Антигены в целом – это молекулы, которые несут информацию о клетке (подобно информации на бейдже у человека, где указываются основные данные этого человека).
Индивидуальные и видовые антигены – что это? Зачем нужны эти антигены?
Имеются антигены индивидуальные, то есть присущие только данному конкретному организму. Эти индивидуальные антигены разные у всех людей, есть похожие друг на друга, но все равно отличающиеся. Двух одинаковых копий индивидуальных антигенов в природе не существует!
Второй основной тип антигенов – это видовые антигены, то есть присущие какому-либо конкретному виду живых существ. Например, у человека присутствует свой видовой антиген, общий для всех людей, у мышей имеется свой мышиный видовой антиген и т.д. На поверхности каждой клетки обязательно присутствуют видовой и индивидуальный антиген.
Видовой антиген используют клетки иммунной системы для опознавания «свой – чужой».
Как происходит узнавание ангигена?
Иммунная клетка связывается с подозрительной клеткой и проводит опознание именно по индивидуальному антигену. В памяти иммунной клетки «записано» как выглядит «свой антиген». Таким образом, если антиген подозрительной клетки совпадает с описанием «свой антиген», значит, эта клетка собственного организма и опасности не представляет. Тогда иммунная клетка «отвязывается» и уходит. А если антиген не совпадает с описанием «свой», тогда иммунная клетка идентифицирует эту клетку как «чужой», а значит потенциально опасный для всего организма. В этом случае иммунная клетка не «отвязывается», а начинает уничтожать опасный объект. Точность такого иммунологического узнавания поражает воображение – 99,97%. Ошибок практически не бывает!
Что такое антитело, иммунный комплекс?
А что представляет собой антитело?
Антитело – это особая молекула, расположенная на поверхности иммунной клетки. Именно антитело и связывается с антигенами подозрительной клетки. Далее антитело передает информацию внутрь клетки, где происходит опознавание, и получает обратный сигнал двух видов «свой» или «чужой». При сигнале «свой» антитело разрушает связь с антигеном и отпускает клетку.
Что такое иммунный комплекс?
При сигнале «чужой» ситуация разворачивается иначе. Антитело не разрывает связь с антигеном, а наоборот, посылая специфические сигналы, вызывает «подкрепление». Биологически это означает, что другие антитела, находящиеся в другой части клетки, начинают перемещаться к участку, откуда идет сигнал опасности, и также образуют связь между собой и пойманным антигеном. В конце концов, антиген оказывается, окружен со всех сторон и прочно привязан.Такой комплекс антиген + антитело называется иммунный комплекс. С этого момента начинается утилизация антигена. Но сейчас подробности процесса нейтрализации антигена нас не интересуют.
Виды антител (IgA, IgM, IgG, IgD, IgE)
Антитела – это белковые структуры, которые, соответственно, имеют химическое название, которое и используется как синоним слова антитела. Итак,антитела = иммуноглобулины.
Существуют 5 типов иммуноглобулинов (Ig), которые связываются с разными видами антигенов в разных местах человеческого организма (например, на коже, на слизистых, в крови и т. д.). То есть антитела имеют разделение труда. Эти иммуноглобулины называются буквами латинского алфавита – A, M, G, D, E и обозначаются следующим образом – IgA, IgM, IgG, IgD, IgE.
В диагностике используют только один вид антител, который наиболее специфичен в отношении определяемого микроба. То есть связывание данного вида антител с определяемым антигеном происходит всегда. Чаще всего применяются IgG и IgM.
Именно этот принцип иммунной реакции (уникальная точность и специфичность узнавания определяемого биологического объекта) лежит в основе иммуноферментного анализа.В силу высокой точности антител в узнавании антигенов, точность всего метода иммуноферментного анализа оказывается также высочайшей.
Ферментативная реакция
Какая реакция – ферментативная? Что такое сродство, субстрат и продукт реакции?
Перейдем к рассмотрению ферментативной реакции в работе метода иммуноферментного анализа.
Что такое ферментативная реакция?
Ферментативная реакция – это химическая реакция, при которой одно вещество под действием фермента превращается в другое. Вещество, на которое действует фермент,называется субстратом. А вещество, которое получается в результате воздействия фермента, называетсяпродуктом реакции. Причем особенность ферментативной реакции такова, что определенный фермент действует только на определенный субстрат. Такое свойство фермента узнавать «свой» субстрат называется сродством.
Таким образом, каждый фермент проводит только одну, специфичную для него реакцию. Ферментов в биологическом мире известно великое множество, равно как и ферментативных реакций. В иммуноферментной диагностике используется лишь несколько ферментативных реакций – не более 10.При этом выбирали такие ферментативные реакции, продуктом которых являются окрашенные вещества. Почему же продукты ферментативной реакции должны быть окрашенными? Потому что для вычисления концентрации вещества по окрашенному раствору существует простой химический метод – колориметрия.
Метод колориметрии – суть и принцип
Колориметрия применяет измерение плотности окраски раствора, а по плотности окраски вычисляют концентрацию вещества.При этом специальный прибор – колориметр измеряет плотность окраски раствора. В колориметрии возможны два варианта зависимости плотности окраски от концентрации вещества – это прямо пропорциональная зависимость или обратно пропорциональная зависимость. При прямо пропорциональной зависимости, чем выше концентрация вещества, тем интенсивнее плотность окраски раствора. При обратно пропорциональной зависимости, чем выше концентрация вещества, тем ниже плотность окраски раствора. Технически это происходит так: берется несколько растворов с известной концентрацией вещества, измеряется плотность этих растворов, строится график зависимости концентрации от плотности окраски (калибровочный график).
Далее измеряют плотность окраски раствора, концентрацию которого выясняют, и по калибровочному графику находят значение концентрации, соответствующее уровню измеренной плотности окраски раствора.В современных автоматических колориметрах только один раз проводят калибровку, далее аппарат сам строит калибровочную кривую, которая остается в памяти прибора, и измерение происходит автоматически.
В иммуноферментном анализе чаще всего применяются следующие ферменты: пероксидаза, щелочная фосфатаза, авидин.
Как же совмещаются иммунологическая и ферментативная реакция в иммуноферментном анализе? Сейчас мы перейдем к рассмотрению собственно иммуноферментного анализа. Какие этапы он включает и что происходит при протекании этих реакций? Иммуноферментный анализ бывает прямой и непрямой.
Прямой иммуноферментный анализ – этапы проведения
В прямом иммуноферментном анализе используют антитела к выявляемому антигену, соединенные со специфической меткой. Эта специфическая метка и есть субстрат ферментативной реакции.
Прикрепление антигенов к поверхности лунки и соединение антигена с антителом
Как проходит прямой иммуноферментный анализ? Берется биологический материал (кровь, соскобы со слизистых, мазки) и помещается в специальные лунки. Биологический материал оставляют в лунках на 15-30 минут, чтобы антигены могли приклеиться к поверхности лунок. Далее в эти лунки добавляют антитела к выявляемому антигену. Это значит, что выявляя антигены, например, сифилиса, добавляются антитела против антигенов сифилиса. Эти антитела получают промышленным способом, а лаборатории покупают уже готовые наборы.Данную смесь исследуемого материала и антител оставляют на некоторое время (от 30 минут до 4-5 часов), чтобы антитела смогли найти и связаться со «своим» антигеном.Чем больше в биологической пробе антигенов, тем больше антител свяжется с ними.
Удаление «лишних» антител
Как было указано, антитела к тому же связаны со специфической меткой.Поскольку антитела добавляются в избытке, то не все они свяжутся с антигенами, а если антигена вообще нет в пробе, то, соответственно, ни одно антитело не свяжется с искомым антигеном. Для того чтобы убрать «лишние» антитела, содержимое из лунок просто выливают. В результате этого все «лишние» антитела убираются, а остаются те, которые связались с антигенами, поскольку антигены «приклеены» к поверхности лунок. Лунки несколько раз ополаскивают специальным раствором, который позволяет вымыть все «лишние» антитела.
Ферментативная реакция – образование окрашенного соединения
Далее начинается второй этап – ферментативная реакция. В промытые лунки добавляют раствор с ферментом и оставляют на 30-60 минут. Данный фермент имеет сродство к веществу (специфической метке), с которым связаны антитела. Фермент проводит реакцию, в результате которой эта специфическая метка (субстрат) превращается в окрашенное вещество (продукт). Затем методом колориметрии находят концентрацию этого окрашенного вещества. Поскольку данная специфическая метка связана с антителами, значит, концентрация окрашенного продукта реакции равна концентрации антител. А концентрация антител равна концентрации антигенов. Таким образом, в результате проведенного анализа мы получаем ответ, какова концентрация выявляемого микроба или гормона.
Именно так проходит прямой иммуноферментный анализ. Однако сегодня чаще используют непрямой иммуноферментный анализ, поскольку чувствительность и точность непрямого выше, чем прямого. Итак, перейдем к непрямому иммуноферментному анализу.
Непрямой иммуноферментный анализ – этапы проведения
В непрямом иммуноферментном анализе два этапа. При проведении первого этапа используют немеченые антитела к выявляемым антигенам, а во втором этапе применяют меченые антитела к первым немеченым антителам. То есть получается не прямое связывание антитела с антигеном, а двойной контроль: связывание антител с антигеном, после чего связывание вторых антител с комплексом антитело + антиген. Как правило, антитела для первого этапа – мышиные, а для второго – козьи.
Фиксация антигенов на поверхности лунки и связывание антигена с немеченым антителом
Так же как и для прямого иммуноферментного анализа производится забор биологического материала – кровь, соскобы, мазки. Исследуемый биологический материал вносят в лунки и оставляют на 15-30 минут для приклеивания антигенов к поверхности лунок. Затем в лунки вносят немеченые антитела к антигенам и оставляют на промежуток времени (1-5 часов), чтобы антитела связались со «своими» антигенами и образовали иммунный комплекс (первый этап). После чего удаляют «лишние», не связавшиеся антитела, путем выливания содержимого лунок. Производят промывку специальным раствором для полного удаления всех не связавшихся антител.
Связывание меченого антитела с комплексом антиген + немеченое антитело
После чего берут вторые антитела – меченые, добавляют в лунки и опять оставляют на некоторое время – 15-30 минут (второй этап). За это время меченые антитела связываются с первыми – не мечеными и образуют комплекс – антитело + антитело + антиген. Однако и меченые, и не меченые антитела вносятся в лунки в избытке. Поэтому нужно опять удалить «лишние», уже меченые антитела, которые не связались с немечеными антителами. Для этого повторяют процедуру выливания содержимого лунок и промывки специальным раствором.
Ферментативная реакция – образование окрашенного соединения
После чего вносят фермент, осуществляющий реакцию превращения «метки» в окрашенное вещество. Окраска развивается в течение 5-30 минут. Затем проводят колориметрию и вычисляют концентрацию окрашенного вещества. Поскольку концентрация окрашенного вещества равна концентрации меченых антител, а концентрация меченых равна концентрации немеченых антител, которая, в свою очередь равна концентрации антигена. Таким образом, получаем концентрацию выявляемого антигена.
Такой двойной контроль в виде использования двух видов антител позволил повысить чувствительность и специфичность метода иммуноферментного анализа. Несмотря на удлинение времени проведения анализа и включение дополнительных этапов, эти потери компенсируются точностью результата. Именно поэтому в настоящее время подавляющее большинство методик иммуноферментного анализа – это непрямой иммуноферментный анализ.
Какие заболевания выявляют методом иммуноферментной диагностики?
Перейдем к рассмотрению того, какие заболевания и какие биологически активные вещества выявляются методом иммуноферментного анализа. Вещества, выявляемые методом иммуноферментного анализа, представлены в таблице.
Гормоны и маркеры заболеванийщитовидной железы
Тиреопероксидаза (ТПО)
Тиреоглобулин (ТГ)
Тиреотропный гормон (ТТГ)
Тироксин (Т4)
Трийодтиронин (Т3)
Свободный тироксин (Т4)
Свободный трийодтиронин (Т3)
Диагностика репродуктивной функции Лютеинизирующий гормон (ЛГ)
Фолликулостимулирующий гормон (ФСГ)
Хорионический гонадотропин (ХГ)
Пролактин
Прогестерон
Эстрадиол
Тестостерон
Кортизол
Стероид связывающий глобулин (ССГ)
Альфафетопротеин (АФП)
Онкомаркеры Хорионический гонадотропин (ХГ)
Простатспецифический антиген (ПСА)
СА – 125
СА – 19.9
CYFRA – 21-1
М – 12 (СА – 15.3)
MUC – 1 (M – 22)
MUC1 (M – 20)
Альвеомуцин
К – цепь
L – цепь
Фактор некроза опухолей (ФНОα)
γ – интерферон
Раково-эмбриональный антиген (РЭА)
Диагностика инфекционных заболеваний Токсоплазма (IgG, IgM)
Краснуха (IgG, IgM)
Цитомегаловирус (IgG, IgM)
Герпес (IgG, IgM)
Туберкулез (IgG, IgM)
Корь (IgG, IgM)
Гепатит Д, Е, А (ВГД, ВГЕ, ВГА)
Гепатит С (ат ВГС, ВГСсore)
Гепатит В (НВs, НВе НВсore)
Уреаплазма (IgG, IgM)
Микоплазма (IgG, IgM)
Хламидия (IgG, IgM)
Микоплазма (IgG)
Сифилис (IgG)
Аспергиллёз (IgG)
Лямблии (IgG)
Helicobacter Pylori (IgG)
Псевдотуберкулез (IgG, IgM)
Кандида (IgG)
Герпес (IgG, IgM)
Эпштейн-Барр (IgG, IgM)
Цитомегаловирус (IgG, IgM)
Диагностика аутоиммунных заболеваний и определение иммунного статуса IgE – общий
С-реактивный белок (СРБ)
Глиадин (IgG, IgA)
IgG4
Общий IgG
IgG2
Общий IgA
Секреторный IgA
Общий IgD
Общий IgМ
Циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК)
Маркеры заболеваний сердца Тропонин I
В таблице приведен далеко не полный перечень анализов (только наиболее распространенные), выполняемых с помощью иммуноферментного анализа. Привести же весь список не представляется возможным, поскольку он будет очень большим и постоянно пополняющимся. Помимо лабораторной диагностики метод иммуноферментного анализа широко используется в научных исследованиях.
Ранняя диагностика заболеваний»
С ее помощью возможно:
• Оценить общую иммунореактивность организма, выявить иммуносупрессию или активацию.
• Провести раннюю диагностику многих нарушений в организме задолго до появления первых симптомов болезни.
• Провести раннюю диагностику уже имеющихся или только начинающихся заболеваний у взрослых и детей.
• Поставить или уточнить диагноз в сложных случаях.
• Помочь пациентам при неэффективности лечении а также оценить эффективность проводимого лечения.
• Помочь пациентам с тяжелыми инфекционными патологиями (особенно вирусной этиологии).
• Оценит иммунную реактивность организма часто и длительно болеющих детей и взрослых.
• Оценить и спрогнозировать течение беременности на ранних сроках. Помочь в решении проблем бесплодия, угрозы выкидыша, рождения здорового ребенка. Предотвратить аномальное развитие беременности и плода.
• Провести вакцинацию без осложнений (иммунодиагностика, подготовка к вакцинации, создание индивидуального графика прививок).
• Проводить диспансеризацию больших коллективов.
• Индивидуально подобрать наиболее эффективное лечение имеющихся заболеваний и снизить риски развития многих осложнений за счет своевременного выявления патологии.
• Дать прогноз ожидаемых изменений в состоянии здоровья и рекомендовать мероприятия, направленные на снижение или предотвращение риска развития болезней.
Технология ЭЛИ-тестов:
В настоящее время в научном мире происходит пересмотр основной парадигмы медицины, которая заключается в принципе: «ВЫЯВЛЕНИЕ БОЛЕЗНИ — ЛЕЧЕНИЕ».Этот пересмотр заключается в попытке повернуть медицинскую науку и практику от лечения к предотвращению развития заболеваний (перейти от принципа:«БОЛЕЗНЬ — ЛЕЧЕНИЕ» к принципу «РАННЯЯ ДИАГНОСТИКА — ПРОГНОЗ И ПРОФИЛАКТИКА»).
Примером этой новой концепции в медицине является разработанный профессором НИИ нормальной физиологии имени П.К. Анохина РАМН и научным руководителем МИЦ«ИММУНКУЛУС» Александром Борисовичем Полетаевым метод ранней диагностики заболеваний на основе технологии «Иммункулус» (методы группы ЭЛИ-Тест). Технология ЭЛИ-Тест (сокращение от ELISA — Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) — это совокупность диагностических методов, основанных на твердофазном иммуноферментном анализе, позволяющих выявлять отклонения в содержании сывороточных аутоантител класса IgG определенной антигенной специфичности. Выявленные отклонения отражают стойкие молекулярные перестройки, имеющие место в тех или иных клетках и их негативное влияние на состояние разных органов и систем человека. В основе данной методики лежит концепция, по которой иммунная система содержит образ индивидуального человеческого организма, отражающий особенности его молекулярного (антигенного) состава. Иммунная система осуществляет постоянный мониторинг состава тела и его сравнение с исходным образцом — матрицей и при расхождении запускает механизм коррекции, призванный восстановить исходный образ. Материальной основой, обеспечивающей создание и сохранение матрицы, отражающей антигенно-метаболическое состояние индивидуального организма, является система естественных аутоантител и антигенспецифических Т-клеточных рецепторов. Аутоантитела, направленные к разным антигенам собственного организма (аутоантигенам) синтезируются в организме человека на протяжении всей жизни. Сывороточное содержание аутоантител у здоровых людей приблизительно одинаково. В отличие от состояния нормы, сывороточные концентрации многих аутоантител заметно меняются при развитии различных заболеваний. Эти изменения можно выявить задолго до клинической манифестации заболевания. Эти изменения, весьма специфичны для каждой патологии, дают хорошие шансы на максимально раннее выявление только формирующихся патологических изменений на начальных стадиях, то есть в период полностью обратимых изменений.
Поэтому данные об уровнях наиболее значимых аутоантител в последнее время называют «ИММУННЫМ ПОРТРЕТОМ ЧЕЛОВЕКА» или «ИММУННЫМ ПАСПОРТОМ». В основе «ИММУННОГО ПАСПОРТА» взрослого лежит определение содержания 24 аутоантител класса иммуноглобулинов G разной органной специфичности: к нервной системе, миокарду, печени, почкам, легким, желудку, кишечнику, щитовидной железе, поджелудочной железе, надпочечникам,, простате, сперматозоидам, тромбоцитам, эндотелию сосудов, а также к антигенам, характеризующим состояние иммунной системы. Используемые антигены являются основными органными антигенами-мишенями, повышенный синтез аутоантител к которым наблюдается при заболеваниях различной этиологии и с различными механизмами патогенеза. «ИММУННЫЙ ПАСПОРТ» ребенка позволяет оценить текущее состояние основных органов и систем организма ребенка, позволяет выявить текущие патологические процессы и выявить группы рисков развития заболеваний. Таким образом «ИММУННЫЙ ПАСПОРТ» дает врачам новые возможности для сверхранней диагностики заболеваний, определения групп риска развития заболеваний и проведении своевременной профилактики выявленной патологии для достижения главной цели — сохранения и укрепления здоровья.
ПЦР
Полимеразная цепная реакция — это изящный метод, имитирующий естественную репликацию ДНК и позволяющий обнаружить единственную специфическую молекулу ДНК в присутствии миллионов других молекул.
Открытие метода полимеразной цепной реакции (ПНР) стало одним из наиболее выдающихся событий в области молекулярной биологии за последние десятилетия. Это позволило поднять медицинскую диагностику на качественно новый уровень.
Основные принципы использования праймеров (коротких искусственно синтезированных молекул ДНК) и состав ингредиентов, входящих в реакционную смесь для получения копий ДНК впервые были описаны Kleppe с соавт. в 1971 году. Однако тогда еще не была продемонстрирована основная черта ПЦР — экспоненциальное увеличение количества копий фрагмента исходной ДНК как результат реакции.
В 1983 году сотрудник фирмы «Cetus» Kary Mullis предложил метод, ставший в дальнейшем известным как полимеразная цепная реакция. Суть метода заключается в многократном копировании (амплификации) в пробирке определенных участков ДНК в процессе повторяющихся температурных циклов. На каждом цикле амплификациисинтезированные ранее фрагменты вновь копируются ДНК-полимеразой. Благодаря этому происходит многократное увеличение количества специфических фрагментов ДНК, что значительно упрощает дальнейший анализ.
Следует отметить, что этому открытию сопутствовало развитие некоторых технологий. В частности, появление приборов, позволяющих автоматически синтезировать одноцепочечные фрагменты ДНК (олигонуклеотиды). В тот же период были обнаружены уникальные микроорганизмы, живущие в гейзерах. Их ферментативная система, в частности ДНК-полимераза, выдерживает высокие температуры горячих источников и сохраняет свою биологическую активность вплоть до 95°С, что является необходимым условием для проведения полимеразной цепной реакции.
Результатом открытия ПЦР стало почти немедленное практическое применение метода. В 1985 годуSaiki с соавт. опубликовали статью, в которой была описана амплификация геномной последовательности Р-глобина. С этого момента количество публикаций, в которых авторы сообщали о применении ПЦР в своих работах, стало увеличиваться в геометрической прогрессии. Метод приобрел такую популярность, что сегодня уже трудно представить работу в области молекулярной биологии без его использования. Особенно бурное развитие метод полимеразной цепной реакции получил благодаря международной программе «Геном человека». Были созданы современные лазерные технологии сиквенирования (расшифровки нуклеотидных последовательностей ДНК). Если в недавнем прошлом для расшифровки последовательности ДНК размером в 250 пар нуклеотидов (п.н.) требовалась неделя, то современные лазерные сиквенаторы позволяют определять до 5000 п.н. в день. Это в свою очередь способствует значительному росту информационных баз данных, содержащих последовательности ДНК различных биологических объектов. В настоящее время предложены различные модификации ПЦР, показана возможность создания тест-систем для обнаружения микроорганизмов, выявления точечных мутаций, описаны десятки различных применений метода.
1. Перспективы практического использования ПЦР-диагностики
По данным журнала LabMedica International с 1995 года наблюдается увеличение расходов на ПЦР-диагностику, что является показателем роста использования ПЦР в практической медицине. Американские ученые отмечают, что в 1996 г. на ДНК-диагностику было потрачено 181.6 миллионов долларов, а к 2003 году, по прогнозам экспертов, затраты возрастут до 1400.0 миллионов долларов.
По данным того же журнала в настоящее время наиболее быстро развиваются пять основных направлений ПЦР-диагностики:
диагностка инфекционных заболеваний;
диагностика онкологических заболеваний;
диагностика генетических заболеваний;
идентификация личности;
диагностика патогенов в пище.
Главным направлением развития рынка ДНК-диагностики является диагностика инфекционных заболеваний. В отличие от иммуноферментного анализа (ИФА), который широко используется в этой области, ДНК-диагностика позволяет определять непосредственно возбудителя заболевания. С помощью усовершенствованных схем постановки ПЦР можно выявлять патогенные микроорганизмы в очень низкой концентрации.
ДНК-диагностика онкологических заболеваний ограничивается небольшим, но активно возрастающим количеством сведений о генах, ассоциированных с опухолевыми заболеваниями. В рамках проекта «Геном человека» ученые продолжают поиски мутаций, ассоциированных с этой патологией.
Диагностика генетических заболеваний, также как и онкологических, может развиваться только вслед за проведением широких научных исследований генома человека. Медицинское сообщество уже осознало важность изучения генетической основы заболеваний, а также возможность диагностики и начала лечения болезни до появления ее симптомов.
По оценкам экспертов, идентификация личности, включающая судебную медицину, криминалистику, трансплантацию органов и тканей, одно из наиболее крупных и быстрорастущих направлений на рынке ДНК-диагностики. Ожидается ежегодный прирост расходов в этом секторе на 21,3%.
Рынок ДНК-диагностики патогенов в пище является самым скромным. В настоящее время на ДНК-диагностику микробного загрязнения производимых продуктов питания приходится менее 5% от общего количества методов, применяемых для тестирования загрязненности продуктов (культуральные методы и методы с использованием моноклональных антител). Однако методы ДНК-диагностики являются, по оценкам экспертов, более быстрыми, точными и информативными, что в ближайшее время, по-видимому, приведет к резкому возрастанию их доли на рынке ДНК-диагностики в этой области.
2. Механизм полимеразной цепной реакции
2.1. Компоненты реакционной смеси
Для проведения полимеразной цепной реакции необходимо наличие в реакционной смеси ряда компонентов:
Праймеры -искусственно синтезированные олигонуклеотиды, имеющие, как правило, размер от 15 до 30 п.н., идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени. Они играют ключевую роль в образовании продуктов реакции амплификации. Правильно подобранные праймеры обеспечивают специфичность и чувствительность тест-системы.
Taq-полимераза — термостабильный фермент, обеспечивающий достраивание 3′-конца второй цепи ДНК согласно принципу комплементарности (рис. 1, 2).
Смесь дезоксинуклеотидтрифосфатов (дНТФ) — дезоксиаденозинтрифосфа-та (дАТФ), дезоксигуанозинтрифосфата (дГТФ), дезоксицитозинтрифосфата (дЦТФ) и дезокситимидинтрифосфата (дТТФ) — «строительный материал», используемый Taq-полимеразой для синтеза второй цепи ДНК.
Буфер — смесь катионов и анионов в определенной концентрации, обеспечивающих оптимальные условия для реакции, а также стабильное значение рН.
Анализируемый образец — подготовленный к внесению в реакционную смесь препарат, который может содержать искомую ДНК, например, ДНК микроорганизмов, служащую мишенью для последующего многократного копирования. При отсутствии ДНК-мишени специфический продукт амплификации не образуется.
2.2. Циклический температурный режим
Если в анализируемом образце присутствует искомая ДНК, то в процессе реакции амплификации с ней происходит ряд событий, обеспечиваемых определенными температурными циклами. Каждый цикл амплификации состоит из трех этапов (рис. 3):
1. Денатурация. На первом этапе необходимо расплести двойную цепь ДНК, находящуюся в образце. Для этого реакционную смесь нагревают до 92-95°С, в результате чего двухцепочечные молекулы ДНК расплетаются с образованием двух одноцепочечных молекул.
2. Отжиг. На втором этапе праймеры присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени. Этот процесс носит название «отжиг» (от англ. «annealing»).
Праймеры подбирают так, что они ограничивают (фланкируют) искомый фрагмент и комплементарны противоположным цепям ДНК.
Отжиг происходит в соответствии с правилом комплементарности Чаргаффа, означающим, что в двухцепочечной молекуле ДНК напротив аденина всегда находится тимин, а напротив гуанина — цитозин (см. рис. 1). Если это условие не соблюдено, то отжига праймеров не происходит (рис. 4).
После отжига праймеров Taq-полимераза начинает достраивание второй цепи ДНК с 3 ‘-конца праймера.
3. Элонгация (синтез). На третьем этапе температуру в реакционной смеси доводят до оптимума работы Taq-полимеразы, и синтез второй цепи продолжается с максимальной эффективностью.
Иногда, в случае близкого значения температуры отжига праймеров и температуры оптимума работы фермента, становится возможным использовать двухэтапный ПЦР, совместив отжиг и элонгацию.
Температурный цикл амплификации многократно повторяется (30 и более раз). На каждом цикле количество синтезированных копий фрагмента ДНК удваивается (см. рис. 2).
Результатом циклического процесса является экспоненциальное увеличение количества специфического фрагмента ДНК, которое можно описать формулой:
А = М*(2п-п-1)~2п,где
А — количество специфических (ограниченных праймерами) продуктов реакции амплификации;
М — начальное количество ДНК-мишеней;
п — число циклов амплификации.
Реальное значение эффективности отдельных циклов амплификации составляет по некоторым данным 78-97%. В случае присутствия в пробе ингибиторов реакции это значение может быть намного меньше, поэтому фактическое количество специфических продуктов амплификации лучше описывает формула:
А = М*(1+Е)п,где
Е — значение эффективности реакции.
Следует заметить, что в процессе амплификации на исходной цепи синтезируются и длинные фрагменты (см. рис. 2), однако их накопление происходит лишь в арифметической прогрессии по формуле
К = М*п, где
К — количество длинных продуктов амплификации.
Таким образом, специфические фрагменты, ограниченные на концах праймерами, впервые появляются в конце второго цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации.
2.3. «Эффект плато»
Следует заметить, что процесс накопления специфических продуктов амплификации по геометрической прогрессии идет лишь ограниченное время, а затем его эффективность критически падает. Это связано с так называемым «эффектом плато».
Термин «эффект плато» используют для описания процесса накопления продуктов ПЦР на последних циклах амплификации, когда количество ампликонов достигает 0,3-1 пмолей.
В зависимости от условий и количества циклов реакции амплификации, на момент достижения «эффекта плато» влияют: утилизация субстратов (дНТФ и праймеров); стабильность реагентов (дНТФ и фермента); количество ингибиторов, включая пирофосфаты и ДНК-дуплексы; неспецифические продукты или праймер-димеры, конкурирующие за праймеры, дНТФ и полимеразу; концентрация специфического продукта и неполная денатурация при высокой концентрации продуктов амплификации. Чем меньше начальная концентрация ДНК-мишени, тем выше риск выхода реакции на плато. Этот момент может наступить до того, как количество специфических продуктов амплификации будет достаточно, чтобы их можно было проанализировать. Избежать этого позволяют лишь хорошо оптимизированные тест-системы.
3. Стадии постановки ПЦР
ПЦР-анализ состоит из трех стадий (рис. 5).
3.1. Подготовка пробы биологического материала
Для подготовки пробы к постановке ПЦР используют различные методики в зависимости от поставленных задач. Их суть заключается в экстракции (извлечении) ДНК из биопрепарата и удалении или нейтрализации посторонних примесей для получения препарата ДНК с чистотой, пригодной для постановки реакции амплификации.
Иногда бывает достаточно прокипятить образец в течение 5-10 минут, однако в большинстве случаев требуются более трудоемкие методы.
Стандартной и ставшей уже классической считается методика получения чистого препарата ДНК, предложеннаяМагтиг. Она включает в себя ферментативный протеолиз клеток с последующей депротеинизацией и переосаждением ДНК спиртом. Однако это метод довольно трудоемок и предполагает работу с такими агрессивными и имеющими резкий запах веществами, как фенол и хлороформ.
Одним из популярных в настоящее время является метод выделения ДНК, предложенный Boom с соавторами. Этот метод основан на использовании для лизиса клеток сильного хаотропного агента — гуанидина тиоционата (GuSCN) и последующей сорбции ДНК на носителе (стеклянные бусы, диатомовая земля, стеклянное «молоко» и т.д.). После отмывок в пробе остается ДНК, сорбированная на носителе, с которого она легко снимается с помощью элюирующего буфера. Метод удобен, технологичен и пригоден для подготовки образца к амплификации. Однако возможны потери ДНК вследствие необратимой сорбции на носителе, а также в процессе многочисленных отмывок. Особенно большое значение это имеет при работе с небольшими количествами ДНК в образце. Кроме того, даже следовые количества GuSCN могут ингибировать ПНР. Поэтому при использовании этого метода очень важен правильный выбор сорбента и тщательное соблюдение технологических нюансов. Следует отметить, что из-за большого количества стадий добавления и удаления растворов при работе с образцом требуется аккуратность, т.к. возможна перекрестная контаминация между пробами образующейся аэрозолью ДНК.
Другая группа методов пробоподготовки основана на использовании ионообменников типа Chilex, которые, в отличие от стекла, сорбируют не ДНК, а, наоборот, примеси, мешающие реакции. Как правило, эта технология включает две стадии: кипячение образца, в результате чего клеточные стенки разрушаются, а нуклеиновые кислоты выходят в раствор; и сорбция примесей на ионообменнике. Метод чрезвычайно привлекателен простотой исполнения. В большинстве случаев он пригоден для работы с клиническим материалом. К сожалению, иногда встречаются образцы с такими примесями, которые невозможно удалить с помощью ионообменников. Кроме того, клеточные стенки некоторых микроорганизмов не поддаются разрушению простым кипячением. В этих случаях необходимо введение дополнительных стадий обработки образца.
При массовом скрининге, когда важно получить статистические данные, допускается использование простых методов с применением детергентов или обработки биологического материала щелочами с последующей их нейтрализацией. В то же время, использование подобных методов пробоподготовки для клинической диагностики может приводить к ложноотрицательным результатам, вследствие использования в реакционной смеси некачественного препарата ДНК.
Таким образом, к выбору метода пробоподготовки следует относиться с пониманием целей проведения предполагаемых анализов.
3.2. Амплификация
Для проведения реакции амплификации необходимо приготовить реакционную смесь и внести в нее анализируемый образец ДНК. При этом важно учитывать некоторые особенности отжига праймеров. Дело в том, что, как правило, в анализируемом биологическом образце присутствуют разнообразные молекулы ДНК, к которым используемые в реакции праймеры имеют частичную, а в некоторых случаях значительную, гомологию. Кроме того, праймеры могут отжигаться друг с другом, образуя праймер-димеры. И то, и другое приводит к значительному расходу праймеров на синтез побочных (неспецифических) продуктов реакции и, как следствие, значительно уменьшает чувствительность системы. Это затрудняет или делает невозможным учет результатов реакции при проведении электрофореза.
3.2.1. Способ постановки ПЦР с использованием «горячего старта»
Чтобы уменьшить риск образования неспецифических продуктов реакции амплификации, используют подход, получивший название «горячий старт» (от англ. «hot-start»). Суть его состоит в предотвращении возможности начала реакции до момента достижения в пробирк
|
Ceramide III (ЦЕРАМИД III, Ceramide NP), чистый
290.00 руб. | 
Хроно-активный мультикомплекс (витамины, гикозамингликаны, минералы, белки, экстракты), 10 г
260.00 руб. | 
Syn-Coll (Син-Колл) Аналог, 1000 ppm
260.00 руб. | 
Гликарин, актив против гликации кожи, 20 г
490.00 руб. | 
Olivem 1000 (Оливем 1000), 50 г
530.00 руб. | 
HYDRASALINOL (Гидрасалинол) - новый эффективный увлажнитель кожи, 2 мл
690.00 руб. | 
Кокоилглутамат динатрия (Disodium Cocoyl Glutamate), 250 г
390.00 руб. | 
Ши (каритэ) масло рафинированное, 100 г
150.00 руб. | 
GALOLIVE TEN (Галолив Тен), ламеллярный эмульгатор
360.00 руб. |
|
|
Сейчас посетителей на форуме: 29 Гости
Всего сообщений: 131682
Всего тем: 2572
Зарегистрировано пользователей: 32967
Страница сгенерирована за: 0.2175 секунд
|
|
|
|
|
|
